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HPLC-ICP-MS分析雄黄在大鼠脏器中代谢的砷形态

嘉峪检测网        2017-02-13 23:07

HPLC-ICP-MS分析雄黄在大鼠脏器中代谢的砷形态

 

1 引言 
  近年来,中药慢性中毒问题受到人们的高度重视。中药雄黄在我国传统医学中有着悠久的历史,具有解毒杀虫,燥湿祛痰,截疟等功效[1]。2010 年版《中国药典》[1]规定雄黄饮片中As2S2的含量应不低于90%,并对As2O3的量进行了限制。现代医学研究表明,雄黄在治疗白血病[2]、癌症[3]等恶性疾病方面也有不错的疗效。尽管雄黄具有这种独特的疗效,但由于其属于含砷矿物药,使其具有一定的毒性,而其毒性大小与砷的化学形态密切相关[4~6]。Rana等[7]报道了,砷暴露可通过干扰抗氧化防御系统?#22270;?#23567;SOD2 的基因表达,从而对肝、肾造成损伤。 
  目前,测定砷形态的分析方法主要有高效?#21512;?#33394;?#23376;?#30005;感耦合等离子质谱联用技术(HPLC ICP MS)[8~10]、高效?#21512;?#33394;?#23376;?#27682;化物发生 原子荧光联用技术(HPLC HG AFS)[11,12]、高效?#21512;?#33394;?#23376;?#27682;化物发生 原子吸收联用技术(HPLC HG AAS)[13]、毛细管电泳与电感耦合等离子质谱联用技术(CE ICP MS)[14,15]、高效?#21512;?#33394;?#23376;?#30005;喷雾离子质谱联用技术(HPLC ESI MS)[16],主要用于食品等领域的测定,未见在雄黄代谢中应用的报道。 
  本实验建立了HPLC ICP MS测定雄黄在大鼠肝肾中代谢砷形态的方法,为研究雄黄在大鼠体内的代谢提供支持,同时考察了样品前处理过程中砷形态之间的转化,并运用此法对雄黄在大鼠肝、肾中代谢后的砷形态进行了初步研究,为进一步研究雄黄的药代动力学提供合适的方法。 

 

  2 实验部分 
  2.1 仪器与试剂 
  1200 型高效?#21512;?#33394;谱仪及7500a 型电感耦合等离子体质谱仪(ICP MS,美国Agilent 公司);Dionex IonPac AS19 阴离子交换柱(250 mm × 4 mm, 10 μm);Milliplus 2150 超纯水处理系?#24120;?#32654;国Millipore 公司);数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(美国?#32431;?#26364;公司)。 
  (NH4)2CO3, NH3?H2O, H2O2(30%)、冰醋酸、NaCl均为优级纯;砷标?#22025;?#36136;:亚砷酸根离子\[As]、 砷酸根离子\[As]、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(AsB),均购于中国计量科学研究院。超纯水(电阻率18.2 MΩ?cm)。 
  2.2 质?#23376;?#33394;谱条件 
  ICP MS 条件:RF入射功率1450 W,载气为高纯氩气,载气流速0.65 L/min,辅助气流速0.45 L/min, 射频电压1.72 V,采样深度7.8 mm,泵速0.3 r/s,检测同位素 75As和35Cl。 
  HPLC 条件:Dionex IonPac AS 19 阴离子分析柱;流动相: 20 mmol/L (NH4)2CO3 (pH=9.7);流速:1.2 mL/min;柱温为室温;进样体积:25 μL。 
  2.3 染毒方法 
  取4周龄Wistar大鼠4只,体重(50 ± 10)g。分为低、中、高剂量组,给药剂量分别为0.3, 0.9和2.7 g/kg (以0.5% CMC 为混悬介质),对照组给予0.5 % CMC (羧甲基纤维素钠),雄黄染毒组灌胃给药,每天灌胃1 次,连续6星期。染毒期间每3 天称重1 次,调节灌胃剂量。实验动物室温度(24±1) ℃, 相对湿度(50±5)%,每天12 h光照,动物可自由摄?#25104;?#27700;。于末次给药2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,取肝脏和肾脏。 
  2.4 样品前处理方法 
  称取0.3~0.4 g (精确到0.001 g)粉碎后的试样,加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液,?#34892;?#28151;匀后,60 ℃ 水浴超声2 h, 于4 ℃ 冰箱中静置5 min后,取出,于4 ℃以9000 r/min离心10 min,上清液过0.2 μm滤膜。同时制备各试?#37327;?#30333;溶液。 

 

  3 结果与讨论 
  3.1 色谱条件的优化 
  阴离子交换色谱和阳离子交换色谱均可用于砷形态分析。根据砷化合物的离子特性,阴离子交换色谱通常用来分析As、As、MMA 和 DMA,而阳离子交换色谱用于分离AsB、AsC、TMAO 和TETRA。 
  在阴离子交换色谱中,AsB 和As在中性pH 条件下于死体积处共洗脱。通过向流动相中加入酒石酸后,使As与酒石酸形成阴离子的络合物,在色谱柱内产生较强的保留特性,从而使As与AsB 分开[17]。?#37096;?#36890;过增大pH值至9.0 以上[18]或将As氧化成As实现与AsB 的分离。 
  本实验采用Dionex IonPac AS 19阴离子色谱柱,以20 mmol/L (NH4)2CO3 作流动相,对流动相的pH 值和流速进行了优化。

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来源:AnyTesting

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